制备FFPE切片
固定样本：
1.样品剖分后，立即放入 10% NBF，在室温 (RT) 下固定组织 16-32 小时。根据组织类型和大小，固定时间有所不同。固定时间少于 16 小时或长于 32 小时将影响 RNAscope® 分析的结果。
样本的脱水、包埋和切片：
1. 用 1X PBS 清洗样品。
2. 使用乙醇进行逐级脱水，然后使用二甲苯对样品进行透明。
3. 采用标准流程将样品包埋在石蜡中。
注：包埋的样品在15-20℃下干燥保存，若保存时间超过 1年，为确保RNA的质量，建议在 2-8℃下保存。
4. 根据需要修剪石蜡块，用切片机将包埋的组织切成5 +/- 1 µm的切片。将石蜡切片放入40-45℃的水浴，将切片贴附到 SUPERFROST® PLUS 载玻片上。
5. 在室温下过夜风干载玻片。
停止点可选。 请使用3 个月以内制备的组织切片。请在室温下使用干燥剂储存切片。
制备用于 RNAscope®2.5 分析的 FFPE 玻片
烤片
1. 在干燥箱中于 60℃下烤片1小时。停止点可选。烤片完成后立即使用，或在室温下使用干燥剂储存，储存时间不超过1周。储存过久可能会导致样品RNA降解。
2. 如果烤片完成后继续脱蜡约20分钟。
注：如果您选择画疏水圈停止点，可在第二天准备用于样品预处理和 RNAscope® 2.5分析的材料。
制备固定冰切
第 1 部分：组织切片的制备
固定样本
1. 如果需要，用新鲜制备的含4%多聚甲醛（PFA）的 1×PBS 灌注组织，或直接转到步骤2。
2. 解剖组织并放到新鲜制备的4%PFA 中，4℃ 下固定 24 小时。
冷冻组织
1. 4℃下把组织浸入含 10% 蔗糖的 1×PBS 中，直到组织沉到容器底部（脑组织大约 18 小时）。
2. 在含20% 蔗糖的 1×PBS 中重复这一步骤，之后是在含30% 蔗糖的 1×PBS 中，每次都要等组织沉到容器底部。
3. 在 OCT 包埋介质中用干冰或液氮冷冻组织，并在- 80℃将其储存在一个密封的容器中。
制备切片
1. 在组织切片前，在低温恒温器中，于- 20℃下平衡组织块至少1 小时。
2. 以 7-15 µm 厚度切组织块，将切片粘附到SuperFrost® Plus 载玻片（Fisher Scientific # 12-550-15）上。务必使用SuperFrost® Plus 载玻片，其他类型载玻片可能导致组织脱片
3. 在- 20℃空气干燥载玻片20分钟，或如果不立即使用载玻片，于-80℃保存载玻片< 3个月。
4. 载玻片置于Tissue-Tek® 载玻片架上，用200 mL 1×PBS 清洗载玻片 5 分钟，上下移动载玻片架去除OCT。
贴壁细胞收集：
细胞培养
1. 在细胞固定前一天，把细胞接种到含生长培养基的培养腔室培养载玻片上，接种细胞密度以固定时达到80-90%为宜。
细胞固定
1. 去掉生长培养基，拆卸腔室。
2. 把玻片浸入含有 1×PBS 的清洗皿中。任何时候不要让细胞变干。总是使用足够的溶液浸没所有的细胞。
3. 去掉 1×PBS，加入 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）。室温（RT）下孵育 30 分钟。
4. 去掉NBF，用 1×PBS 轻轻冲洗玻片，重复两次。
脱水和保存细胞
1. 去掉最后洗涤的 1×PBS，更换为 50 mL 50% 乙醇。室温孵育 5 分钟。
2. 去掉 50% 乙醇，更换为 50 mL 70% 乙醇。 室温孵育 5 分钟。
3. 去掉 70% 乙醇，更换为 50 mL 100% 乙醇。 室温孵育 5 分钟。
4. 去掉 100% 乙醇，更换为新鲜的 100% 乙醇。 室温孵育10分钟。
注：细胞玻片在 100% 乙醇中、 -20℃条件下可保存长达6个月。
